抗肿瘤多肽药物的作用机制及研究进展

　　

摘要：肿瘤是世界医学的难题, 寻找高效、低毒、易得的抗肿瘤药物迫在眉睫。在众多种类的抗肿瘤药物中, 小分子多肽类药物以其分子量小、靶向性强、活性高、毒性弱、易于穿膜吸收等特点在抗肿瘤的实验研究及临床应用中得到广泛关注。小分子多肽具有抗肿瘤机制的多样性和合成的准确性及便利性, 其不同功能片段可被融合使用, 以增强其作用的靶向性、高效性。本文从多肽药物的不同抗肿瘤机制入手, 分别对促凋亡多肽、免疫疗法多肽以及融合多肽抗肿瘤作用机制和活性研究做了简要概述, 为多肽靶向、高效抗肿瘤研究提供新的思路。

关键词： 抗肿瘤 细胞凋亡 融合多肽 免疫治疗

肿瘤是一种恶性疾病, 是世界医学的难题。目前临床上常用的疗法及药物均难以避免靶向性弱、副作用强、耐药性频发等弊端, 寻找高效、低毒、易得的抗肿瘤药物迫在眉睫。根据2015年全国肿瘤登记中心收集的恶性肿瘤登记资料显示, 近几年我国恶性肿瘤发病率与死亡率居高不下 [1] , 寻找安全、有效的抗肿瘤药物的需求变得越来越迫切。多肽类药物凭借其靶向性、安全性、特异性, 使其在抗肿瘤药物的研制中受到关注, 不同的多肽药物具有多种不同的作用机制, 其可抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡达到直接抗肿瘤作用, 也可以通过增强和激发机体对肿瘤细胞的免疫应答、抑制肿瘤血管生成等达到间接的抗肿瘤作用, 而且其作用机制的多样性和特异性, 也可以实现多肽改造和融合, 实现多肽的高效、靶向、特异的抗肿瘤作用。

展开剩余87%1 促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤多肽

肿瘤的发生不但与细胞的异常增殖和分化有关, 也与细胞的凋亡异常有关。促进肿瘤细胞凋亡是目前药物最重要及最普遍的抗肿瘤机制之一 [2] 。通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现抗肿瘤作用的多肽来源多种多样, 最常见的有从动植物、微生物中提取的多肽、生物及化学合成方法得到的多肽 [3] 。

1.1 提取分离获得的促凋亡抗肿瘤多肽

海洋生物是抗肿瘤多肽的重要来源, 目前已分离出300多种环肽类化合物 [4] 。膜海鞘素类环状缩肽是从加勒比海的被囊动物Trididemnum solchrm中分离出来一组多肽化合物, 经研究证实其具有细胞毒活性, 尤其是膜海鞘素B (didemnin B) 的体内筛选结果证明其具有强烈的抗B16黑色素瘤和抗P388白血病活性, 浓度≥100 nmol·L-1时可诱导HL-60肿瘤细胞的迅速凋亡, 并可促进许多转化细胞的凋亡, 是首个进入美国临床研究的海洋天然产物, 临床试验结果表明didemnin B对非霍奇金淋巴瘤具有抑制作用 [5] 。Aplidine是didemnin B的类似物, 结构的简单改变使这种环缩肽的心脏毒性和神经毒性降低, 诱导凋亡的活性却增强, 成为研究新宠 [6] 。

1.2 生物及化学合成的促凋亡抗肿瘤多肽

近年来发现很多机体自身存在的蛋白具有抗肿瘤作用, 可采用生物或化学合成方法得到机制清楚、靶向性强的抗肿瘤多肽类药物 [7] 。IAP是肿瘤细胞中凋亡抑制蛋白, 通过与Caspase3、Caspase7、Caspase9结合来抑制细胞凋亡。线粒体来源的半胱氨酸水解酶激活剂/低等电点IAP结合蛋白 (Smac/DIABLO) , 是一种线粒体促凋亡蛋白, 能够竞争性抑制IAPs, 诱导肿瘤细胞走向凋亡 [8] 。Samc/DIABLO在体细胞中普遍表达, 但在肿瘤细胞中表达却显著降低, Guo等 [9] 通过合成具有AVPI (Ala-Val-ProIle) 结构的多肽即smac类似物, 体外实验发现smac短肽能够穿透细胞膜, 从而发挥对肿瘤的促进凋亡作用。另一个备受关注的促凋亡蛋白是Bcl-2家族, 其促凋亡分子存在BH1、BH2、BH3、BH4结构域, 从促凋亡蛋白中提取的BH3多肽前景被一度看好, 但由于其易被酶降解且难以跨膜等弊端, 促使固相肽合成方法得到的BH3应用更为广泛, 人工合成的BH3构象稳定, 能抵御酶的降解, 还能与靶蛋白特异结合从而发挥促进肿瘤细胞凋亡的作用 [10] 。

2 具有免疫治疗的抗肿瘤多肽

肿瘤的发生是由于体细胞突变引起的, 突变的肿瘤在机体被识别为外来物质。由于肿瘤诱导的机体免疫力低下, 肿瘤能够逃避机体免疫反应 [11] 。肿瘤的免疫治疗是运用免疫学原理及方法, 增强肿瘤细胞的免疫原性, 提高对效应细胞杀伤的敏感性, 增强和激发机体对肿瘤的免疫应答, 协同免疫系统抑制或杀伤肿瘤的一种新的抗肿瘤方法 [12] 。为了开发出个体化的癌症疗法, 越来越多的研究人员致力于调查个体对癌症产生的免疫反应, 以寻找为患者量身定制的治疗途径 [13] 。

2.1 靶向免疫细胞的多肽

免疫治疗首先要解除肿瘤对免疫系统的抑制作用, 恢复机体正常免疫应答。检查点阻断 (checkpoint blockade) 是一种利用免疫反应来治疗肿瘤的强大新策略 [14] 。在许多个体中, 免疫抑制受细胞毒T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA-4) 和程序性死亡受体1 (PD-1) 调节, 这是两个在T细胞表面表达的免疫负调节受体, 肿瘤细胞表面存在某种抗原, 为特异性结合这两种免疫因子的配体, 结合后抑制了机体的免疫应答, 从而逃脱了免疫反应 [15] 。研究者通过靶向CTLA-4/PD-1的单克隆抗体治疗 (检查点阻断) , 阻断PD-1/PD-L1的结合, 发现可以通过抗PD-1、抗CTLA-4的治疗而重新激活T细胞, 从而解除肿瘤对免疫系统的抑制 [16] 。

2.2 提高免疫原性多肽

免疫治疗的第二个重点是提高肿瘤的免疫原性, 增强免疫系统对其的识别。研究发现, 肿瘤中并不是所有突变基因都能导致其抗原性, 因此提取并筛选突变抗原成为研究者们的首要工作 [17] 。由于人类肿瘤蕴含了大量体细胞突变, 如果一种多肽存在组织相容性复合体基因Ⅰ (MHCⅠ) 突变, 就会被当做外来抗原而产生免疫反应。最近研究表明, 突变肽可以成为T细胞表位, 然而这种突变被描述的非常少, 因为突变表位的筛选非常困难, 需要识别抗原库并进行外显子测序 [18] 。Mahesh等 [19] 将全外显子组序列分析技术与质谱技术联合使用, 来识别两种广泛应用的小鼠肿瘤模型中的抗原决定簇。首先利用免疫沉淀反应将小鼠结肠癌细胞 (MC-38) 和小鼠前列腺癌 (TRAMP-C1) 肿瘤细胞具有抗原性的多肽分离并提取, 然后测量其RNA序列, 经比较分析, MC-38中筛选出外显子突变的多肽28 439种, 进一步分析其编码突变, 预测出1 290种与MHCⅠ相关的突变肽, 接着用MS鉴定, 有7种多肽经光谱确认为存在MHCⅠ基因。通过分析这7种多肽野生型和突变型基因的IC50值以及突变位点, 预测出可在机体内引起T细胞免疫应答的突变肽有2种:Reps1和Adpgk。经过体内实验验证两种多肽确实引起机体免疫应答, 与对照组相比出现了脾脏中CD8显著增多的现象。另有研究者通过生物信息学电脑模拟并分析所有错义突变基因, 分析基因与T细胞表面抗体的亲和度以初步筛选突变基因。

2.3 免疫增强多肽

免疫治疗的另一重点是增加免疫细胞、免疫因子活性, 提升免疫应答的强度, 从而特异、迅速杀伤肿瘤。目前肿瘤疫苗的研究激起了科学家们的兴趣 [20] 。肿瘤特异性疫苗加上相应的免疫佐剂能显著提高肿瘤疫苗的疗效。这种免疫佐剂即Hp91, 是从HMGB1的B box区提取的短肽。具有免疫增强的作用。Diahnn等 [21] 用多聚乳酸纳米粒免疫刺激肽刺激内皮生长因子转基因模型鼠, 发现肿瘤疫苗加免疫佐剂加纳米剂型能够有效地预防和治疗小鼠HER-2阳性乳腺癌 [22] 。

3 其他机制抗肿瘤多肽

3.1 诱发溶酶体去极化的抗肿瘤多肽

Bastiaan等 [23] 从海蛤蝓中提取分离了Kahalalide F环酯肽, 体内外研究证实其具有抗肿瘤作用, 现已进入Ⅱ期临床。其抗癌机制与触发溶酶体去极化而引起的细胞肿胀有关。Sewell等 [24] 在研究中进一步证明ATP耗竭在KF环酯肽抗癌机制中的核心地位。

3.2 抑制肿瘤血管生成的抗肿瘤多肽

海兔毒素10 (dolastatin 10) 是从海洋软体动物海兔中分离得到的一种抗肿瘤线性五肽, 是一种天然毒性短肽 [25] 。研究发现, 其能够显著降低肿瘤血管高达90%的血流量, 其作用机制可能是抑制微管聚合, 促进微管解聚, 从而影响肿瘤血管的微管功能, 进一步干扰肿瘤细胞的有丝分裂 [26] 。

3.3 抑制肿瘤细胞增殖抗肿瘤多肽

许多研究表明, 从海洋软体动物文蛤中可提取出多种多肽, 并普遍具有抑制肿瘤细胞增殖, 激活超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶的作用 [27] 。有人经过一系列的分离纯化步骤从文蛤体液中提取到一种多肽Mere15, MTT比色结果显示其能在体外抑制肺癌细胞A549增殖, IC50值达到34.90μg·m L-1 [28] 。

4 不同作用机制的抗肿瘤融合多肽

肿瘤发病机制多变, 病情复杂, 单独使用某种多肽对肿瘤的控制并不全面, 因此近年来有人将不同作用机制的小分子多肽联合应用, 达到多重抗肿瘤作用, 形成抗肿瘤融合多肽。融合多肽是指在不影响其结构和功能的前提下, 将两种或以上短肽经生物合成融合为一段多肽, 使各段功能相互配合并更好地发挥抗肿瘤作用 [29] 。融合多肽的作用机制不一, 可根据实验目的自行设计、合成、改造, 是较理想并热门的抗肿瘤药物。

4.1 穿膜融合肽抗肿瘤作用

为了提高多肽的跨膜转运能力, 多将短肽和穿膜肽连接, 以辅助药物穿膜作用, 穿膜小分子多肽的引入, 使得药物更易进入肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞发挥直接和间接抗肿瘤活性。

细胞穿膜肽中转录激活子蛋白属于阳离子CPPs。具有很强的跨膜转运能力, 能够携带比其相对分子质量大100倍的外源性大分子进入细胞。是参与小分子蛋白类进入细胞的膜转运蛋白, 在大多数细胞表面均起作用。

核转录激活因子TAT蛋白是最常用的辅助穿膜肽 [30] 。钟嘉莉等 [31] 设计并合成了核转录激活因子-卵巢癌特异结合肽-丝裂原活化蛋白激酶6突变体[靶向融合肽TAT-OSBP-MKK6 (E) ], 该多肽分为3个功能区:TAT作为蛋白转导区, OSBP是经筛选合成的卵巢癌细胞HO8910特异结合区, MKK6则是发挥抗肿瘤作用的效应区。实验证明该融合蛋白能够选择性地作用于卵巢癌细胞, 并在体内外诱导卵巢癌细胞凋亡 [32] 。梁爱玲 [33] 也运用了与此相似的构思, 设计合成了TAT-DV1-BH3融合多肽。其中DV1是与细胞中CXCR4特异结合的人工合成肽, 而CXCR4是肿瘤中特异存在的膜性趋化因子受体, 具有调节肿瘤转移的功能。合成的DV1既能靶向结合到肿瘤表面, 又能竞争性抑制CXCL12与CXCR4的结合, 从而抑制肿瘤在体内的迁移。BH3为人工合成的P53上调凋亡调控因子的效应结构域, 是发挥促进肿瘤细胞凋亡作用的肽段。经多种体内外实验证实了该融合多肽设计的可行性与实用性 [34] 。

4.2 靶向肿瘤细胞融合肽抗肿瘤作用

为了提高多肽对肿瘤细胞的靶向性, 可选择肿瘤中特异性高表达的受体, 并筛选与其特异结合的配体结构, 人工合成其序列, 作为融合肽的靶向功能肽段 [35] 。VEGF即血管内皮生长因子, 其受体VEFGR在体细胞中低表达, 在肿瘤细胞中却特异性高表达 [36] 。VEGF能与细胞表面VEGFR的胞外区结合, 并激活下游信号通路, 发挥促血管生成作用 [37] 。秦浙学等 [38] 制备了188Re-MAG3-QKRKRKKSRYKS, 其中188Re是作为标记的放射性核素, MAG3是间接标记的双功能螯合剂, 最后的十二肽为VEGF的一段无活性外显子, 与肿瘤细胞表面VEGFR结合后能够抑制肿瘤血管生长, 从而达到抗肿瘤作用。之后该多肽又经多次改造, 提高了其与VEGFR的亲和力, 以及对肿瘤细胞的抑制率 [39] 。

4.3 靶向肿瘤血管融合肽抗肿瘤作用

肿瘤的生长、侵袭和转移离不开血管的营养供给及血管新生, 阻碍血管生成或破坏现有血管是近年来抗肿瘤药物的热门靶点之一。整合素在肿瘤内皮血管细胞表面特异性表达, 是靶向肿瘤血管的一个重要位点。其中的整合素avβ3在肿瘤再生血管内皮细胞表面有特异性表达, 而在正常组织中很少表达。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (RGD) 三肽序列对avβ3有很强亲和力, 融合多肽中RGD的引入不但能达到靶向肿瘤血管的作用, 同时具有抑制肿瘤血管新生, 促进其坏死或凋亡的作用。将HPMA-RGD共轭可用于靶向肿瘤新生血管, 增加药物在肿瘤的浓度和累积量, 与放射性核素联合应用还可用于肿瘤的无创性检查, 达到治疗和诊断的双应用。

5 展望

面对肿瘤的复杂多变性, 越来越多的研究人员致力于开发抗肿瘤多肽及个体化的靶向抗肿瘤多肽, 以寻找为患者量身定制的治疗途径 [40] 。根据不同肿瘤细胞的生理特点, 可选择适合某种肿瘤的特异性治疗多肽;随着免疫疗法的研究热度不断升高, 肿瘤疫苗的研制成为肿瘤个体化疗法又一理想的治疗手段;根据肿瘤的不同发育阶段和组织的特异性, 可进行抗肿瘤多肽改造和融合, 提高抗肿瘤的作用和靶向性。多肽类药物具有分子量小, 易于改造, 合成方便, 靶向性强, 活性高, 毒性低等优势, 尤其是结合现代分析手段、合成方法, 使提取分离并改造合成更具特异性的抗肿瘤多肽成为可能。根据不同的目的有针对性地合成融合多肽, 将在未来的肿瘤个体化治疗中拥有不可限量的前景。

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